Содержание
Эта статья — о том, как одноклеточные организмы, которых принято считать примитивными, оказались способны на нечто поразительно «социальное». Бактерии обмениваются химическими сигналами, и этот процесс, известный как quorum sensing, позволяет им координировать поведение целых популяций. Они выделяют крохотные молекулы, отслеживают их концентрацию вокруг себя и — когда сигнал достигает порогового уровня — синхронно переключают экспрессию генов. Биолюминесценция, формирование биопленок, выброс токсинов — всё это запускается не по команде одной клетки, а по коллективному решению. Ниже — о том, как устроен этот механизм на молекулярном уровне, чем различаются «языки» грамположительных и грамотрицательных бактерий, как патогены используют коллективный сигнал для атаки на хозяина и почему попытки глушить бактериальное общение стали одним из направлений борьбы с устойчивостью к антибиотикам.
Свет из моря: с чего всё началось
Первые подсказки о том, что бактерии обмениваются химическими сигналами, появились в конце 1960-х — начале 1970-х годов. Венгерский микробиолог Александр Томаш обнаружил, что для генетической компетенции пневмококков (Streptococcus pneumoniae) необходимы внеклеточные молекулы — то есть клетки «ждали» чего-то снаружи, прежде чем включить определённые программы. Параллельно исследователи морских бактерий заметили, что свечение культур Vibrio fischeri зависит от плотности популяции: в разбавленном виде клетки тёмные, а при достижении определённой концентрации — вспыхивают разом.
Но по-настоящему всё сложилось в 1980-х. Химически идентифицировали саму сигнальную молекулу — N-(3-оксогексаноил)-гомосеринлактон (3OC6-HSL). Выяснилось, что её синтезирует фермент LuxI, а воспринимает транскрипционный фактор LuxR. Когда молекула 3OC6-HSL связывается с LuxR, этот комплекс активирует транскрипцию оперона luxICDABEG, который и кодирует белки, ответственные за биолюминесценцию. Положительная обратная связь: чем больше сигнала, тем активнее оперон, тем больше и LuxI (а значит — ещё больше сигнала), и LuxR, и люциферазы. Термин «quorum sensing» предложили Клэй Фуква, Стивен Уинанс и Эверетт Грибенберг в 1994 году — по аналогии с кворумом в голосовании: бактерии «голосуют» молекулами и действуют только тогда, когда набирается достаточное число «голосов».
Зачем кальмару светящиеся бактерии
История V. fischeri — пожалуй, самый элегантный пример того, как quorum sensing работает в природе. Эти бактерии живут в симбиозе с гавайским кальмаром Euprymna scolopes, заселяя его световой орган. Ночью кальмар охотится у поверхности воды, и его тело отбрасывает тень в лунном свете — лёгкая мишень для хищника снизу. Свечение бактерий компенсирует эту тень, создавая так называемый эффект контриллюминации. Для кальмара это камуфляж. Для бактерий — комфортная ниша с питательными веществами.
В световом органе плотность V. fischeri чрезвычайно высока, и концентрация автоиндуктора 3OC6-HSL легко превышает пороговый уровень. Поэтому lux-оперон активен, и клетки светятся. Но свободноплавающие клетки в толще океана слишком разрежены — сигнал рассеивается, люцифераза не экспрессируется, и бактерии остаются тёмными. Интересно, что кальмар не просто пассивно пользуется светом. Мутантные штаммы V. fischeri, неспособные светиться (с поломками в luxA, luxI или luxR), первоначально колонизируют орган, но уже через 48 часов их численность падает до 25–30% от уровня дикого типа. Хозяин, по сути, штрафует «молчаливых» симбионтов — отказывая им в ресурсах.
Более того, помимо основной системы LuxI/LuxR, у V. fischeri есть вторая: AinS/AinR. Фермент AinS синтезирует другой автоиндуктор — октаноилгомосеринлактон (C8-HSL). Эта система активируется при умеренных плотностях, задолго до срабатывания lux-системы, и «подогревает» экспрессию LuxR через транскрипционный регулятор LitR. Получается иерархия: при умеренной плотности ain-система готовит клетку к будущему свечению, а при высокой плотности — подключается мощная lux-система. Такой двухступенчатый механизм обеспечивает тонкую настройку ответа.
Два «языка»: лактоны и пептиды
Бактерии обмениваются химическими сигналами по-разному — и разница во многом определяется строением клеточной стенки.
Грамотрицательные бактерии — с их тонким слоем пептидогликана — преимущественно используют ацилированные гомосеринлактоны (AHL). Это небольшие органические молекулы, которые легко диффундируют через мембрану наружу и обратно. У каждого вида — свой «диалект»: длина и модификации ацильной цепи различаются, что обеспечивает определённую специфичность сигнала. Система LuxI/LuxR у V. fischeri — классический пример, но гомологи этих генов найдены у сотен видов грамотрицательных бактерий.
Грамположительные устроены иначе. У них толстая пептидогликановая стенка, через которую гомосеринлактоны просто так не пройдут. Поэтому они используют модифицированные олигопептиды — так называемые автоиндуцирующие пептиды (AIP). Пептиды синтезируются как предшественники, подвергаются ферментативной модификации (часто включающей образование тиолактонного или лактонного кольца) и активно экспортируются наружу — обычно с помощью ABC-транспортёров. Снаружи они связываются не с внутриклеточным рецептором, а с мембранной гистидинкиназой, запускающей каскад фосфорилирования.
Самый изученный пример — система Agr (accessory gene regulator) у Staphylococcus aureus. Локус agr содержит четыре гена: agrB кодирует трансмембранную эндопептидазу, которая модифицирует и экспортирует пептид-предшественник agrD, превращая его в зрелый AIP длиной 7–9 аминокислот с тиолактонным кольцом. Снаружи AIP связывается с сенсорной гистидинкиназой AgrC, которая фосфорилирует регулятор ответа AgrA. Фосфорилированный AgrA активирует промотор P2 (автоиндукция — положительная обратная связь) и промотор P3, с которого транскрибируется RNAIII — главный эффектор вирулентности. Именно RNAIII контролирует выработку ферментов, суперантигенов и токсинов, включая фенол-растворимые модулины (PSM) — амфипатические пептиды, вызывающие лизис клеток хозяина.
Pseudomonas aeruginosa: три системы в одном патогене
Если V. fischeri — модельный организм для изучения quorum sensing в симбиозе, то Pseudomonas aeruginosa — модельный в контексте инфекционной патологии. Этот грамотрицательный оппортунист вызывает тяжёлые пневмонии, раневые инфекции и хронические колонизации лёгких у пациентов с муковисцидозом. Его система «чувства кворума» — одна из самых сложных среди бактерий: три взаимосвязанные цепи, образующие иерархическую сеть.
На вершине иерархии — система LasI/LasR. Фермент LasI синтезирует автоиндуктор 3OC12-HSL, а транскрипционный фактор LasR, связавшись с ним, активирует не только свои гены-мишени (эластаза LasB, протеазы), но и запускает нижестоящие системы. Вторая система — RhlI/RhlR — использует другой лактон, бутаноилгомосеринлактон (C4-HSL), и управляет продукцией рамнолипидов, пиоцианина и других факторов вирулентности. Причём — и это было неожиданным открытием — RhlR способен функционировать даже без своего «собственного» лактона от RhlI. Исследования показали, что у RhlR существует альтернативный, пока не полностью идентифицированный лиганд, который позволяет этому рецептору контролировать формирование биопленок и вирулентность независимо от классического пути.
Третья система — PQS (Pseudomonas Quinolone Signal) — вообще выбивается из стандартной схемы. Её сигнальные молекулы — 2-алкил-4-хинолоны — не являются гомосеринлактонами. PQS воспринимается рецептором PqsR. Что интересно, PQS-система связана с двумя другими петлями обратной связи: Las-система стимулирует pqs, а Rhl-система — подавляет. Этот «треугольник» — Las–Rhl–PQS — обеспечивает пространственно-временной контроль: на ранних стадиях инфекции, когда бактерий мало, экспрессия вирулентных генов минимальна. Но при достижении критической массы все три системы активируются согласованно, и P. aeruginosa обрушивает на хозяина целый арсенал токсинов, протеаз и экзополисахаридов. По оценкам транскриптомных исследований, совокупно Las, Rhl и PQS регулируют экспрессию более 400 генов.
Универсальный «эсперанто» бактериального мира
Описанные выше системы работают преимущественно внутри одного вида. Но есть сигнал, претендующий на статус межвидового — автоиндуктор-2 (AI-2).
AI-2 синтезируется ферментом LuxS, который изначально был обнаружен у Vibrio harveyi в рамках его второй quorum sensing-цепи. Ключевое отличие AI-2 от AHL: фермент LuxS обнаружен у огромного числа видов — и грамотрицательных, и грамположительных. Его находят у кишечной палочки, сальмонелл, энтерококков, стрептококков и многих других. Химически AI-2 представляет собой производное 4,5-дигидрокси-2,3-пентандиона (DPD), которое спонтанно перегруппируется в несколько взаимопревращающихся форм — фуранозилборат-диэстер у V. harveyi, иная фуранозная форма у E. coli. Именно эта химическая «текучесть» позволяет разным видам реагировать на одну и ту же молекулу, хотя через разные рецепторы.
У вибрионов AI-2 распознаётся периплазматическим белком LuxP, а у E. coli и сальмонелл — белком LsrB, входящим в состав транспортного комплекса Lsr. Но — и это долго озадачивало учёных — многие бактерии, у которых нет ни LuxP, ни LsrB, всё равно реагируют на AI-2. Загадка начала проясняться, когда обнаружили третий тип рецептора: dCACHE-домен, присутствующий, в частности, в хеморецепторах PctA и TlpQ у P. aeruginosa. AI-2 связывается с этими рецепторами и запускает хемотаксис и формирование биоплёнки. Аналогичные dCACHE-домены найдены в белках Bacillus subtilis и Rhodopseudomonas palustris, причём в этих случаях AI-2 усиливал ферментативную активность гистидинкиназы и дигуанилатциклазы.
Впрочем, вопрос о том, является ли AI-2 «истинным» quorum sensing-сигналом или просто побочным продуктом метилового цикла (LuxS участвует и в переработке S-аденозилгомоцистеина — важнейшей метаболической реакции), до сих пор дискутируется. Геномный анализ 138 видов показал, что ген luxS широко распространён, однако рецептор LuxP — только у вибрионов. Это может означать, что для многих бактерий AI-2 — метаболит, а не сигнал. Но растущее число примеров AI-2-зависимого поведения (биоплёнки, вирулентность, колонизация кишечника) указывает на то, что межвидовая роль этой молекулы вполне реальна.
Биоплёнки: крепость, построенная по сигналу
Quorum sensing и биоплёнки связаны теснейшим образом. Биоплёнка — это сообщество бактерий, заключённое в самоорганизующийся матрикс из полисахаридов, белков и внеклеточной ДНК. Внутри этого матрикса бактерии становятся в сотни раз устойчивее к антибиотикам, чем в свободноплавающем (планктонном) состоянии. Формирование биоплёнки — процесс многоступенчатый: начальная адгезия к поверхности, образование микроколоний, созревание с продукцией матрикса, и, наконец, дисперсия — когда часть клеток покидает структуру и колонизирует новые территории. На каждом из этих этапов бактерии обмениваются химическими сигналами — quorum sensing определяет, когда начинать строить защиту, когда наращивать матрикс и когда отступать.
У P. aeruginosa биоплёнка особенно опасна в контексте лёгочных инфекций при муковисцидозе. Полисахариды Pel и Psl, рамнолипиды и феназины — все эти компоненты матрикса регулируются QS. Rhl-система контролирует структуру каналов внутри биоплёнки (они нужны для обмена питательными веществами и сигнальными молекулами), а PQS-система участвует в высвобождении мембранных везикул, которые транспортируют гидрофобные молекулы и нуклеиновые кислоты между клетками. V. cholerae тоже строит биоплёнки через quorum sensing — и именно они обеспечивают успешную колонизацию кишечника хозяина, транспорт нутриентов между микроколониями и в конечном счёте продукцию холерного токсина.
Quorum quenching: глушить, а не убивать
Раз бактерии обмениваются химическими сигналами — quorum sensing, — то эти сигналы можно попытаться перехватить. Так родилась идея quorum quenching (QQ) — подавления бактериального общения как альтернативы классическим антибиотикам.
Принцип привлекателен тем, что QS не является жизненно необходимым для роста бактерий. Бактерия прекрасно делится без «разговоров» — она просто не может координировать групповое поведение. А значит, подавление QS не создаёт жёсткого давления отбора, которое ведёт к формированию устойчивости (по крайней мере, теоретически). Агенты QQ делятся на две категории: низкомолекулярные ингибиторы, которые конкурируют с автоиндукторами за связывание с рецептором, и ферменты quorum quenching — лактоназы и ацилазы, разрушающие молекулы AHL.
Первый описанный QQ-фермент — AiiA из Bacillus thuringiensis — это металлолактоназа с двумя ионами цинка в активном центре. Она гидролизует лактонное кольцо AHL, превращая сигнал в инертное соединение. Фермент проявляет широкую субстратную специфичность с предпочтением длинноцепочечных AHL. С тех пор были обнаружены десятки QQ-ферментов — у почвенных бактерий, морских микроорганизмов, эндофитов растений. У морской бактерии Muricauda olearia, например, найдены принципиально новый класс AHL-лактоназы (MomL) и ацилаза (MomA), аминокислотные последовательности которых менее чем на 30% сходны с ранее известными ферментами.
Есть и примеры из мира бактерий-конкурентов. В кишечнике человека споры рода Bacillus подавляют колонизацию Staphylococcus aureus, вырабатывая фенгицин — липопептид, известный своими противогрибковыми свойствами. Оказалось, что фенгицин также вытесняет AIP из сайтов связывания Agr-системы S. aureus, блокируя его QS и ослабляя вирулентность. Получается, что одни бактерии буквально «глушат» химические переговоры других — причём прямо у нас в желудочно-кишечном тракте.
Когда патогены сотрудничают
Quorum sensing — это не только монолог внутри одного вида. Иногда разные виды бактерий усиливают вирулентность друг друга. Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa нередко совместно инфицируют лёгкие пациентов с муковисцидозом. Их QS-системы оказываются совместимыми: AHL-молекулы одного вида способны активировать рецепторы другого. Результат — синергическое повышение продукции токсинов и усиление воспалительной реакции у пациента.
Межвидовое «подслушивание» создаёт ещё одну проблему для медицины. P. aeruginosa реагирует на AI-2, производимый кишечной микрофлорой хозяина, и модулирует экспрессию своих генов вирулентности. То есть один вид микробов, обитающих в организме, непреднамеренно «подсказывает» патогену, что плотность микробного сообщества достаточно высока — пора включать агрессивную программу. Бактерии обмениваются химическими сигналами — quorum sensing оказывается не просто внутренним делом одного вида, а частью сложной экологической сети.
Вирулентность по расписанию: зачем ждать
Ключевое эволюционное преимущество quorum sensing — экономия ресурсов. Синтез токсинов, протеаз, сидерофоров и других факторов вирулентности — энергетически затратный процесс. Одинокая клетка, выбросившая эластазу в ткань хозяина, ничего не добьётся: концентрация фермента слишком мала, а иммунная система быстро справится с одиночным захватчиком. Но когда тысячи клеток одновременно секретируют токсины, защитные механизмы хозяина оказываются перегружены.
У S. aureus система Agr обеспечивает именно этот переключатель. При низкой плотности клетки экспрессируют поверхностные адгезины — белок A, фибронектин-связывающие белки — для закрепления в тканях. При достижении кворума Agr подавляет гены адгезинов и активирует RNAIII, запуская массированную продукцию секретируемых токсинов. Любопытно, что снижение активности Agr ассоциировано с хроническими инфекциями и формированием биоплёнок, тогда как высокая активность — с острыми, агрессивными формами заболевания. То есть один и тот же патоген «выбирает» стратегию в зависимости от сигнального фона.
У Vibrio cholerae quorum sensing тоже управляет вирулентностью, но с обратной логикой: факторы патогенности активны при низкой плотности, а при высокой — подавляются, и бактерии переключаются на дисперсию. Холерный вибрион, по сути, атакует на начальном этапе колонизации, а затем — распространяется дальше. Для него бактерии обмениваются химическими сигналами — quorum sensing определяет момент «отхода», а не «атаки».
Устойчивость и эволюция: не всё так просто
Идея о том, что подавление QS не вызовет устойчивости, оказалась слишком оптимистичной. На примере P. aeruginosa продемонстрировано, что резистентность к одному из самых изученных ингибиторов QS — бромированному фуранону C-30 — развивается быстро. Мутации в гене mexR приводят к повышению активности эффлюксных помп, которые просто выкачивают ингибитор из клетки. Более того, мутант с устойчивостью к C-30 оказался более вирулентным в модели на Caenorhabditis elegans в присутствии этого ингибитора. И аналогичные мутации mexR обнаруживаются у клинических штаммов из лёгких пациентов с муковисцидозом — то есть они уже существуют в природе.
Тем не менее антивирулентная стратегия на основе quorum quenching продолжает развиваться. Комбинированные подходы — совместное использование QQ-ферментов и QS-ингибиторов — позволяют одновременно атаковать разные звенья сигнальной цепи. Показано, что QQ усиливает эффективность традиционных антибиотиков, повышая чувствительность бактерий в биоплёнках. QQ-ферменты иммобилизуют на мембранах биореакторов для предотвращения биообрастания. Эндофитные бактерии Cannabis sativa оказались способны избирательно разрушать QS-молекулы фитопатогенов — потенциальный инструмент биологического контроля.
Конкуренция сигналов между стафилококками
Система Agr у стафилококков — не только инструмент внутривидовой координации, но и арена межвидовой конкуренции. Существует четыре agr-группы S. aureus, каждая из которых продуцирует свой вариант AIP. AIP одной группы способен ингибировать AgrC-рецептор другой группы — явление, описанное ещё в 1997 году и получившее название «бактериальная интерференция». Но дело не ограничивается внутривидовой борьбой. Коагулазонегативные стафилококки — обычные обитатели кожи — тоже имеют Agr-системы, и их AIP способны подавлять QS S. aureus. Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus simulans вырабатывают пептиды, конкурирующие с AIP S. aureus за связывание с AgrC.
В эксперименте на мышиной модели кожной инфекции AIP S. simulans значительно ослаблял вирулентность метициллин-резистентного S. aureus (MRSA). Это открывает терапевтическую перспективу: вместо того чтобы уничтожать всех стафилококков антибиотиками, можно усилить позиции комменсальных видов, которые естественным образом «глушат» патоген.
Что стоит за кворумом: sensing или diffusion sensing?
Ещё в 2002 году Рози Редфилд предложила альтернативную гипотезу: возможно, то, что мы называем quorum sensing, на самом деле является diffusion sensing — способом клетки оценивать степень ограниченности пространства вокруг себя. Логика простая: если автоиндуктор накапливается, это может означать не только высокую плотность популяции, но и замкнутость среды (например, внутри микроколонии или крипты). В тесном окружении молекулы не рассеиваются, и даже немногие клетки могут «решить», что кворум достигнут. Исследования последних лет частично подтверждают эту идею. Было показано, что единичные клетки S. aureus, заключённые в микрофлюидные камеры нанолитрового объёма, способны активировать Agr-систему — без многомиллионной популяции, просто за счёт накопления AIP в замкнутом пространстве. Quorum sensing, таким образом, — это не столько «перепись населения», сколько оценка локальной концентрации сигнала, которая зависит и от числа клеток, и от диффузионных условий среды.
Автор статьи: проктолог, хирург, Ромодан Наталья Александровна — о враче.
