Содержание
Эта статья — о том, как одноклеточные организмы, которых принято считать примитивными, оказались способны на нечто поразительно «социальное». Бактерии обмениваются химическими сигналами, и этот процесс, известный как quorum sensing, позволяет им координировать поведение целых популяций. Они выделяют крохотные молекулы, отслеживают их концентрацию вокруг себя и — когда сигнал достигает порогового уровня — синхронно переключают экспрессию генов. Биолюминесценция, формирование биопленок, выброс токсинов — всё это запускается не по команде одной клетки, а по коллективному решению. Ниже — о том, как устроен этот механизм на молекулярном уровне, чем различаются «языки» грамположительных и грамотрицательных бактерий, как патогены используют коллективный сигнал для атаки на хозяина и почему попытки глушить бактериальное общение стали одним из направлений борьбы с устойчивостью к антибиотикам.
Свет из моря: с чего всё началось
Первые подсказки о том, что бактерии обмениваются химическими сигналами, появились в конце 1960-х — начале 1970-х годов. Венгерский микробиолог Александр Томаш обнаружил, что для генетической компетенции пневмококков (Streptococcus pneumoniae) необходимы внеклеточные молекулы — то есть клетки «ждали» чего-то снаружи, прежде чем включить определённые программы. Параллельно исследователи морских бактерий заметили, что свечение культур Vibrio fischeri зависит от плотности популяции: в разбавленном виде клетки тёмные, а при достижении определённой концентрации — вспыхивают разом.
Но по-настоящему всё сложилось в 1980-х. Химически идентифицировали саму сигнальную молекулу — N-(3-оксогексаноил)-гомосеринлактон (3OC6-HSL). Выяснилось, что её синтезирует фермент LuxI, а воспринимает транскрипционный фактор LuxR. Когда молекула 3OC6-HSL связывается с LuxR, этот комплекс активирует транскрипцию оперона luxICDABEG, который и кодирует белки, ответственные за биолюминесценцию. Положительная обратная связь: чем больше сигнала, тем активнее оперон, тем больше и LuxI (а значит — ещё больше сигнала), и LuxR, и люциферазы. Термин «quorum sensing» предложили Клэй Фуква, Стивен Уинанс и Эверетт Грибенберг в 1994 году — по аналогии с кворумом в голосовании: бактерии «голосуют» молекулами и действуют только тогда, когда набирается достаточное число «голосов».
Ежедневный приём аспирина для профилактики инфаркта и инсульта: польза и вредЗачем кальмару светящиеся бактерии
История V. fischeri — пожалуй, самый элегантный пример того, как quorum sensing работает в природе. Эти бактерии живут в симбиозе с гавайским кальмаром Euprymna scolopes, заселяя его световой орган. Ночью кальмар охотится у поверхности воды, и его тело отбрасывает тень в лунном свете — лёгкая мишень для хищника снизу. Свечение бактерий компенсирует эту тень, создавая так называемый эффект контриллюминации. Для кальмара это камуфляж. Для бактерий — комфортная ниша с питательными веществами.
В световом органе плотность V. fischeri чрезвычайно высока, и концентрация автоиндуктора 3OC6-HSL легко превышает пороговый уровень. Поэтому lux-оперон активен, и клетки светятся. Но свободноплавающие клетки в толще океана слишком разрежены — сигнал рассеивается, люцифераза не экспрессируется, и бактерии остаются тёмными. Интересно, что кальмар не просто пассивно пользуется светом. Мутантные штаммы V. fischeri, неспособные светиться (с поломками в luxA, luxI или luxR), первоначально колонизируют орган, но уже через 48 часов их численность падает до 25–30% от уровня дикого типа. Хозяин, по сути, штрафует «молчаливых» симбионтов — отказывая им в ресурсах.
Более того, помимо основной системы LuxI/LuxR, у V. fischeri есть вторая: AinS/AinR. Фермент AinS синтезирует другой автоиндуктор — октаноилгомосеринлактон (C8-HSL). Эта система активируется при умеренных плотностях, задолго до срабатывания lux-системы, и «подогревает» экспрессию LuxR через транскрипционный регулятор LitR. Получается иерархия: при умеренной плотности ain-система готовит клетку к будущему свечению, а при высокой плотности — подключается мощная lux-система. Такой двухступенчатый механизм обеспечивает тонкую настройку ответа.
Как мозг перестраивает синапсы во время обучения и запоминанияДва «языка»: лактоны и пептиды
Бактерии обмениваются химическими сигналами по-разному — и разница во многом определяется строением клеточной стенки.
Грамотрицательные бактерии — с их тонким слоем пептидогликана — преимущественно используют ацилированные гомосеринлактоны (AHL). Это небольшие органические молекулы, которые легко диффундируют через мембрану наружу и обратно. У каждого вида — свой «диалект»: длина и модификации ацильной цепи различаются, что обеспечивает определённую специфичность сигнала. Система LuxI/LuxR у V. fischeri — классический пример, но гомологи этих генов найдены у сотен видов грамотрицательных бактерий.
Грамположительные устроены иначе. У них толстая пептидогликановая стенка, через которую гомосеринлактоны просто так не пройдут. Поэтому они используют модифицированные олигопептиды — так называемые автоиндуцирующие пептиды (AIP). Пептиды синтезируются как предшественники, подвергаются ферментативной модификации (часто включающей образование тиолактонного или лактонного кольца) и активно экспортируются наружу — обычно с помощью ABC-транспортёров. Снаружи они связываются не с внутриклеточным рецептором, а с мембранной гистидинкиназой, запускающей каскад фосфорилирования.
Самый изученный пример — система Agr (accessory gene regulator) у Staphylococcus aureus. Локус agr содержит четыре гена: agrB кодирует трансмембранную эндопептидазу, которая модифицирует и экспортирует пептид-предшественник agrD, превращая его в зрелый AIP длиной 7–9 аминокислот с тиолактонным кольцом. Снаружи AIP связывается с сенсорной гистидинкиназой AgrC, которая фосфорилирует регулятор ответа AgrA. Фосфорилированный AgrA активирует промотор P2 (автоиндукция — положительная обратная связь) и промотор P3, с которого транскрибируется RNAIII — главный эффектор вирулентности. Именно RNAIII контролирует выработку ферментов, суперантигенов и токсинов, включая фенол-растворимые модулины (PSM) — амфипатические пептиды, вызывающие лизис клеток хозяина.
Польза закаливания холодной водой для здоровья и иммунитета человекаPseudomonas aeruginosa: три системы в одном патогене
Если V. fischeri — модельный организм для изучения quorum sensing в симбиозе, то Pseudomonas aeruginosa — модельный в контексте инфекционной патологии. Этот грамотрицательный оппортунист вызывает тяжёлые пневмонии, раневые инфекции и хронические колонизации лёгких у пациентов с муковисцидозом. Его система «чувства кворума» — одна из самых сложных среди бактерий: три взаимосвязанные цепи, образующие иерархическую сеть.
На вершине иерархии — система LasI/LasR. Фермент LasI синтезирует автоиндуктор 3OC12-HSL, а транскрипционный фактор LasR, связавшись с ним, активирует не только свои гены-мишени (эластаза LasB, протеазы), но и запускает нижестоящие системы. Вторая система — RhlI/RhlR — использует другой лактон, бутаноилгомосеринлактон (C4-HSL), и управляет продукцией рамнолипидов, пиоцианина и других факторов вирулентности. Причём — и это было неожиданным открытием — RhlR способен функционировать даже без своего «собственного» лактона от RhlI. Исследования показали, что у RhlR существует альтернативный, пока не полностью идентифицированный лиганд, который позволяет этому рецептору контролировать формирование биопленок и вирулентность независимо от классического пути.
Третья система — PQS (Pseudomonas Quinolone Signal) — вообще выбивается из стандартной схемы. Её сигнальные молекулы — 2-алкил-4-хинолоны — не являются гомосеринлактонами. PQS воспринимается рецептором PqsR. Что интересно, PQS-система связана с двумя другими петлями обратной связи: Las-система стимулирует pqs, а Rhl-система — подавляет. Этот «треугольник» — Las–Rhl–PQS — обеспечивает пространственно-временной контроль: на ранних стадиях инфекции, когда бактерий мало, экспрессия вирулентных генов минимальна. Но при достижении критической массы все три системы активируются согласованно, и P. aeruginosa обрушивает на хозяина целый арсенал токсинов, протеаз и экзополисахаридов. По оценкам транскриптомных исследований, совокупно Las, Rhl и PQS регулируют экспрессию более 400 генов.
Какие продукты полезны для здоровья сердца по новым рекомендациям кардиологовУниверсальный «эсперанто» бактериального мира
Описанные выше системы работают преимущественно внутри одного вида. Но есть сигнал, претендующий на статус межвидового — автоиндуктор-2 (AI-2).
AI-2 синтезируется ферментом LuxS, который изначально был обнаружен у Vibrio harveyi в рамках его второй quorum sensing-цепи. Ключевое отличие AI-2 от AHL: фермент LuxS обнаружен у огромного числа видов — и грамотрицательных, и грамположительных. Его находят у кишечной палочки, сальмонелл, энтерококков, стрептококков и многих других. Химически AI-2 представляет собой производное 4,5-дигидрокси-2,3-пентандиона (DPD), которое спонтанно перегруппируется в несколько взаимопревращающихся форм — фуранозилборат-диэстер у V. harveyi, иная фуранозная форма у E. coli. Именно эта химическая «текучесть» позволяет разным видам реагировать на одну и ту же молекулу, хотя через разные рецепторы.
У вибрионов AI-2 распознаётся периплазматическим белком LuxP, а у E. coli и сальмонелл — белком LsrB, входящим в состав транспортного комплекса Lsr. Но — и это долго озадачивало учёных — многие бактерии, у которых нет ни LuxP, ни LsrB, всё равно реагируют на AI-2. Загадка начала проясняться, когда обнаружили третий тип рецептора: dCACHE-домен, присутствующий, в частности, в хеморецепторах PctA и TlpQ у P. aeruginosa. AI-2 связывается с этими рецепторами и запускает хемотаксис и формирование биоплёнки. Аналогичные dCACHE-домены найдены в белках Bacillus subtilis и Rhodopseudomonas palustris, причём в этих случаях AI-2 усиливал ферментативную активность гистидинкиназы и дигуанилатциклазы.
Впрочем, вопрос о том, является ли AI-2 «истинным» quorum sensing-сигналом или просто побочным продуктом метилового цикла (LuxS участвует и в переработке S-аденозилгомоцистеина — важнейшей метаболической реакции), до сих пор дискутируется. Геномный анализ 138 видов показал, что ген luxS широко распространён, однако рецептор LuxP — только у вибрионов. Это может означать, что для многих бактерий AI-2 — метаболит, а не сигнал. Но растущее число примеров AI-2-зависимого поведения (биоплёнки, вирулентность, колонизация кишечника) указывает на то, что межвидовая роль этой молекулы вполне реальна.
Раствор марганцовки при отравлении: эффективность и правилаБиоплёнки: крепость, построенная по сигналу
Quorum sensing и биоплёнки связаны теснейшим образом. Биоплёнка — это сообщество бактерий, заключённое в самоорганизующийся матрикс из полисахаридов, белков и внеклеточной ДНК. Внутри этого матрикса бактерии становятся в сотни раз устойчивее к антибиотикам, чем в свободноплавающем (планктонном) состоянии. Формирование биоплёнки — процесс многоступенчатый: начальная адгезия к поверхности, образование микроколоний, созревание с продукцией матрикса, и, наконец, дисперсия — когда часть клеток покидает структуру и колонизирует новые территории. На каждом из этих этапов бактерии обмениваются химическими сигналами — quorum sensing определяет, когда начинать строить защиту, когда наращивать матрикс и когда отступать.
У P. aeruginosa биоплёнка особенно опасна в контексте лёгочных инфекций при муковисцидозе. Полисахариды Pel и Psl, рамнолипиды и феназины — все эти компоненты матрикса регулируются QS. Rhl-система контролирует структуру каналов внутри биоплёнки (они нужны для обмена питательными веществами и сигнальными молекулами), а PQS-система участвует в высвобождении мембранных везикул, которые транспортируют гидрофобные молекулы и нуклеиновые кислоты между клетками. V. cholerae тоже строит биоплёнки через quorum sensing — и именно они обеспечивают успешную колонизацию кишечника хозяина, транспорт нутриентов между микроколониями и в конечном счёте продукцию холерного токсина.
Quorum quenching: глушить, а не убивать
Раз бактерии обмениваются химическими сигналами — quorum sensing, — то эти сигналы можно попытаться перехватить. Так родилась идея quorum quenching (QQ) — подавления бактериального общения как альтернативы классическим антибиотикам.
Принцип привлекателен тем, что QS не является жизненно необходимым для роста бактерий. Бактерия прекрасно делится без «разговоров» — она просто не может координировать групповое поведение. А значит, подавление QS не создаёт жёсткого давления отбора, которое ведёт к формированию устойчивости (по крайней мере, теоретически). Агенты QQ делятся на две категории: низкомолекулярные ингибиторы, которые конкурируют с автоиндукторами за связывание с рецептором, и ферменты quorum quenching — лактоназы и ацилазы, разрушающие молекулы AHL.
Первый описанный QQ-фермент — AiiA из Bacillus thuringiensis — это металлолактоназа с двумя ионами цинка в активном центре. Она гидролизует лактонное кольцо AHL, превращая сигнал в инертное соединение. Фермент проявляет широкую субстратную специфичность с предпочтением длинноцепочечных AHL. С тех пор были обнаружены десятки QQ-ферментов — у почвенных бактерий, морских микроорганизмов, эндофитов растений. У морской бактерии Muricauda olearia, например, найдены принципиально новый класс AHL-лактоназы (MomL) и ацилаза (MomA), аминокислотные последовательности которых менее чем на 30% сходны с ранее известными ферментами.
Есть и примеры из мира бактерий-конкурентов. В кишечнике человека споры рода Bacillus подавляют колонизацию Staphylococcus aureus, вырабатывая фенгицин — липопептид, известный своими противогрибковыми свойствами. Оказалось, что фенгицин также вытесняет AIP из сайтов связывания Agr-системы S. aureus, блокируя его QS и ослабляя вирулентность. Получается, что одни бактерии буквально «глушат» химические переговоры других — причём прямо у нас в желудочно-кишечном тракте.
Что лучше глицин или магний по мнению врачейКогда патогены сотрудничают
Quorum sensing — это не только монолог внутри одного вида. Иногда разные виды бактерий усиливают вирулентность друг друга. Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa нередко совместно инфицируют лёгкие пациентов с муковисцидозом. Их QS-системы оказываются совместимыми: AHL-молекулы одного вида способны активировать рецепторы другого. Результат — синергическое повышение продукции токсинов и усиление воспалительной реакции у пациента.
Межвидовое «подслушивание» создаёт ещё одну проблему для медицины. P. aeruginosa реагирует на AI-2, производимый кишечной микрофлорой хозяина, и модулирует экспрессию своих генов вирулентности. То есть один вид микробов, обитающих в организме, непреднамеренно «подсказывает» патогену, что плотность микробного сообщества достаточно высока — пора включать агрессивную программу. Бактерии обмениваются химическими сигналами — quorum sensing оказывается не просто внутренним делом одного вида, а частью сложной экологической сети.
Вирулентность по расписанию: зачем ждать
Ключевое эволюционное преимущество quorum sensing — экономия ресурсов. Синтез токсинов, протеаз, сидерофоров и других факторов вирулентности — энергетически затратный процесс. Одинокая клетка, выбросившая эластазу в ткань хозяина, ничего не добьётся: концентрация фермента слишком мала, а иммунная система быстро справится с одиночным захватчиком. Но когда тысячи клеток одновременно секретируют токсины, защитные механизмы хозяина оказываются перегружены.
У S. aureus система Agr обеспечивает именно этот переключатель. При низкой плотности клетки экспрессируют поверхностные адгезины — белок A, фибронектин-связывающие белки — для закрепления в тканях. При достижении кворума Agr подавляет гены адгезинов и активирует RNAIII, запуская массированную продукцию секретируемых токсинов. Любопытно, что снижение активности Agr ассоциировано с хроническими инфекциями и формированием биоплёнок, тогда как высокая активность — с острыми, агрессивными формами заболевания. То есть один и тот же патоген «выбирает» стратегию в зависимости от сигнального фона.
У Vibrio cholerae quorum sensing тоже управляет вирулентностью, но с обратной логикой: факторы патогенности активны при низкой плотности, а при высокой — подавляются, и бактерии переключаются на дисперсию. Холерный вибрион, по сути, атакует на начальном этапе колонизации, а затем — распространяется дальше. Для него бактерии обмениваются химическими сигналами — quorum sensing определяет момент «отхода», а не «атаки».
Детские стимы: понимание, диагностика и подходы к терапииУстойчивость и эволюция: не всё так просто
Идея о том, что подавление QS не вызовет устойчивости, оказалась слишком оптимистичной. На примере P. aeruginosa продемонстрировано, что резистентность к одному из самых изученных ингибиторов QS — бромированному фуранону C-30 — развивается быстро. Мутации в гене mexR приводят к повышению активности эффлюксных помп, которые просто выкачивают ингибитор из клетки. Более того, мутант с устойчивостью к C-30 оказался более вирулентным в модели на Caenorhabditis elegans в присутствии этого ингибитора. И аналогичные мутации mexR обнаруживаются у клинических штаммов из лёгких пациентов с муковисцидозом — то есть они уже существуют в природе.
Тем не менее антивирулентная стратегия на основе quorum quenching продолжает развиваться. Комбинированные подходы — совместное использование QQ-ферментов и QS-ингибиторов — позволяют одновременно атаковать разные звенья сигнальной цепи. Показано, что QQ усиливает эффективность традиционных антибиотиков, повышая чувствительность бактерий в биоплёнках. QQ-ферменты иммобилизуют на мембранах биореакторов для предотвращения биообрастания. Эндофитные бактерии Cannabis sativa оказались способны избирательно разрушать QS-молекулы фитопатогенов — потенциальный инструмент биологического контроля.
Конкуренция сигналов между стафилококками
Система Agr у стафилококков — не только инструмент внутривидовой координации, но и арена межвидовой конкуренции. Существует четыре agr-группы S. aureus, каждая из которых продуцирует свой вариант AIP. AIP одной группы способен ингибировать AgrC-рецептор другой группы — явление, описанное ещё в 1997 году и получившее название «бактериальная интерференция». Но дело не ограничивается внутривидовой борьбой. Коагулазонегативные стафилококки — обычные обитатели кожи — тоже имеют Agr-системы, и их AIP способны подавлять QS S. aureus. Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus simulans вырабатывают пептиды, конкурирующие с AIP S. aureus за связывание с AgrC.
В эксперименте на мышиной модели кожной инфекции AIP S. simulans значительно ослаблял вирулентность метициллин-резистентного S. aureus (MRSA). Это открывает терапевтическую перспективу: вместо того чтобы уничтожать всех стафилококков антибиотиками, можно усилить позиции комменсальных видов, которые естественным образом «глушат» патоген.
Как улучшить качество сна и начать высыпаться: советы экспертов которые работаютЧто стоит за кворумом: sensing или diffusion sensing?
Ещё в 2002 году Рози Редфилд предложила альтернативную гипотезу: возможно, то, что мы называем quorum sensing, на самом деле является diffusion sensing — способом клетки оценивать степень ограниченности пространства вокруг себя. Логика простая: если автоиндуктор накапливается, это может означать не только высокую плотность популяции, но и замкнутость среды (например, внутри микроколонии или крипты). В тесном окружении молекулы не рассеиваются, и даже немногие клетки могут «решить», что кворум достигнут. Исследования последних лет частично подтверждают эту идею. Было показано, что единичные клетки S. aureus, заключённые в микрофлюидные камеры нанолитрового объёма, способны активировать Agr-систему — без многомиллионной популяции, просто за счёт накопления AIP в замкнутом пространстве. Quorum sensing, таким образом, — это не столько «перепись населения», сколько оценка локальной концентрации сигнала, которая зависит и от числа клеток, и от диффузионных условий среды.
